بررسی امکان شناسایی کلونینگ و بیان ژن هورمون رشد فیل ماهی ‭(Huso huso)‬در میزبانهای پروکاریوتی و یوکاریوتی

در این مطالعه، بررسی امکان شناسایی، کلونینگ و بیان ژن رشد فیل ماهی در باکتری و مخمر مورد مطالعه قرار گرفت. در مرحله اول برای شناسایی ژن نمونه برداری از غده هیپوفیز 3 عدد فیل ماهی بالغ انجام شد. سپس ‭RNA ‬استخراج شد و سنتز ‭cDNA ‬براساس ژنهای ثبت شده در ‭NCBI ‬انجام گرفت. نمونه ‭cDNA ‬اختصاصی تکثیر شده در وکتور ‭pTZ‬‮‭57‬‭R ‬کلون گردید و توالی یابی شد. توالی نوکلیوتیدها نشان داد که ژن رشد فیل ماهی دارای قالب باز خواندن ‮‭645‬ جفت باز می باشد که ‮‭214‬ باقیمانده اسید آمینه ای را کد می کند. جایگاه برش سیگنال پپتید در موقعیت ‮‭72‬ ژن پیش بینی شد که سیگنال پپتید ‮‭24‬ اسیدآمینه ای ایجاد می کند و ژن بالغ دارای ‮‭190‬ اسیدآمینه می باشد. بررسی های فیلوژنیک براساس توالی اسیدآمینه ای و نوکلیوتیدی با روش ‭Neighbour- joining ‬و ‭Maximum parsimony ‬انجام شد. درختهای ترسیم شده در هر دو روش دارای توپولوژی مشابه و دارای حمایت بوت استرپ بالا بودند و بیشترین شباهت ابتدا به پستانداران و سپس به مارماهی شکلان مشاهده شد. برای بیان ژن رشد در باکتری، قسمت بالغ ژن تکثیر شد و در وکتور ‭pTZ‬‮‭57‬‭R ‬مطابق با جایگاه برشی ویژه کلون گردید. سپس در وکتور بیانی ‭pET‬‮‭21‬‭a ‬ساب کلون گردید و برای ترانسفورماسیون باکتری بیانی ‭E. coli BL‬‮‭21‬ مورد استفاده قرار گرفت. نتایج نشان داد که با القا کردن با ‭IPTG ‬، هورمون رشد فیل ماهی بیان گردید. نتایج ‭SDS-PAGE ‬و وسترن بلاتینگ نیز باند اختصاصی ‮‭21‬ کیلودالتون برای هورمون رشد را نشان دادند. برای بیان هورمون رشد در مخمر، قسمت بالغ ‭cDNA ‬ابتدا در ‭TA ‬وکتور ‭pTZ‬‮‭57‬‭R ‬کلون گردید و سپس در وکتور بیانی ‭pHILS‬1 ساب کلون گردید. مخمر ‭Pichia pastoris GS‬‮‭115‬ با پلاسمید نوترکیب ترانسفورم گردید. نتایج بدست آمده از تحقیق نشان داد که هورمون رشد نوترکیب با القاگر متانول تولید شده و به محیط کشت ترشح گردیده است. آنالیز بیان با استفاده از ‭RNA‬، ‭SDS-PAGE ‬و وسترن بلاتینگ انجام شد. آنالیز ‭RNA ‬باند اختصاصی ‮‭800‬ جفت بازی را نشان داد. سپس ‭SDS-PAGE ‬و وسترن بلاتینگ باند اختصاصی ‮‭21‬ کیلودالتون را برای هورمون رشد نشان داد. کلمات کلیدی: فیل ماهی، هورمون رشد، مخمر، بیان پروتیین، ‭pHILS‬،1 ‭pET‬‮‭21‬‭a