بررسی امکان استفاده از مارکر مولکولی برای تفکیک تاسماهی ایرانی ‭(Acipenser persicus) ‬و تاسماهی روسی ‭(A.gueldeustadtti)‬

تاسماهی ایرانی بعنوان گونه غالب در خزر جنوبی، بیشترین سهم تولید گوشت و خاویار ایران و درآمد ارزی کشور را بخود اختصاص میدهد ولی از لحاظ سیستماتیک و تمایز این گونه از تاسماهی روسی بحث بر انگیز بوده و تعدادی از محققین روسی بر این باورند که تاسماهی ایرانی یک گونه مستقل نبوده بلکه بعنوان زیرگونه تاسماهی روسی میباشد. این تحقیق با هدف شناسایی و معرفی نشانگر مولکولی مبتنی بر ‭DNA ‬اختصاصی جهت تمایز دو گونه تاسماهی ایرانی و تاسماهی روسی و اثبات مولکولی تمایز آنها انجام گردید. برای این منظور از 8 روش مولکولی شامل: میکروستلایت،‭AFLP‬، ‭RAPD‬، توالی یابی ژن سیتوکروم ‭b ‬، تعیین توالی ژنهای ‮‭16‬‭sDNA ‬و ‭ND‬5 ، ژن رشد ‭(Growth Hormone Gene ) ‬و در نهایت روش نوین ‭SNP ‬استفاده شد. بر حسب روش کار بین ‮‭16-5‬ نمونه بافت باله دمی از هریک از گونه های مورد بررسی از نقاط مختلف دریای خزر، رودخانه سفید رود، اورال ، ولگا جمع آوری شد. پس از استخراج ‭DNA ‬و ارزیابی کمیت و کفیت آن، با استفاده از پرایمر های متعدد (بر حسب نوع ژن و روش کار بین 5 الی ‮‭110‬ پرایمر) واکنش ‭PCR ‬انجام گردید. محصول ‭PCR‬بر روی ژل پلی آکریلامید الکتروفورز گردید و سپس با نیتران نقره رنگ آمیزی شد و یا بر روی ژل آگارز %1 و رنگ آمیزی ایتیدیوم بروماید مشاهده شد. در روش ‭RAPD ‬باندهای متمایز ‭DNA ‬را بر روی ژل برش داده و پس از خالص سازی در وکتور کلون و در باکتری ‭E.coli ‬سویه ‮‭10‬ ‭Top ‬انتقال و سپس توالی یابی شد. بعلاوه ژنهای رشد تاسماهی ایرانی و تاسماهی روسی ابتدا با استفاده از نرم افزار های 4 ‭MEGA ‬و ‭Gene Runner‬، پرایمر های مورد نظر طراحی گردید، پس از تکثیر با ‭PCR ‬در وکتور ‭PTZ‬‮‭57‬‭R/T ‬کلون و در باکتری ‭E.coli ‬سویه ‮‭10‬ ‭Top ‬انتقال و سپس توالی یابی شد. کل محصول ‭PCR ‬حاصله از تکثیر سایر ژنها هم برای تمامی نمونه ها توالی یابی شد و آنالیز آماری، فیلوژنی و درخت تکاملی آنها رسم گردید. در روش پلیمورفیسم تک نوکلیوتیدی ‭(SNP) ‬پس از تشکیل بانک ژنومی ، در مجموع ‮‭14/4‬ میلیارد عدد نوکلیوتید توالی یابی شد و با استفاده از نرم افزار بیوانفورماتیک اختصاصی، آنالیز شباهت و تمایز ژنتیکی دو گونه مورد بررسی انجام گرفت. نتایج بررسی نشان داد که روشهای میکروستلایت و ‭AFLP ‬تنوع ژنتیکی بین و درون گونه ای بسیار بالایی را آشکار ساختند. توالی ژن سیتوکروم ‭b ‬زمانیکه تعداد نمونه 4 عدد برای هریک از دو گونه تاسماهی ایرانی و روسی مقایسه گردید تمایز را نشان میداد ولی با تکرار آزمایش بر روی ‮‭15‬ نمونه برای هر گونه، این روش نتوانست دو گونه را از همدیگر تفکیک نماید. توالی کامل ژنهای ‮‭16‬‭sDNA‬و ‭ND‬5 میتوکندریای نشان داد که دو گونه تاسماهی ایرانی و تاسماهی روسی در بعضی از جایگاهها نوکلیوتیدی تفاوتهایی با یکدیگر دارند ولی اختلاف معنی داری نبود. نتایج توالی حاصل از قطعات کلون شده بروش ‭RAPD‬و همچنین طراحی پرایمر اختصاصی بر مبنای توالی های بدست آمد موفق به تمایز یک باند ‭DNA ‬گردید که میتواند دو گونه را متمایز نماید. نتایج این تحقیق همچنین نشان داد که ژن رشد دو گونه تاسماهی ایرانی و روسی از ‮‭645‬ نوکلیوتید تشکیل یافته و پروتیینی با ‮‭214‬ اسید آمینه را ترجمه میکند. نتایج آنالیز توالی بیانگر آن است که ژن کد گذاری کننده هورمون رشد در تاسماهی ایرانی و روسی بالاترین شباهت را ابتدا با ژن رشد پستانداران (%‮‭71‬) و سپس با مار ماهی شکلان (%‮‭63‬) و کمترین شباهت را با ماهیان استخوانی (%‮‭37‬) دارد. آنالیز فیلوژنی بیانگر آن است که تاسماهی ایرانی و روسی در مقایسه با سایر جانوران از گونه های بسیار قدیمی بوده و این ژن از یک ژن رشد اجدادی منشا گرفته است. در این تحقیق بهترین نتایج از روش پلی مورفیسم تک نوکلیوتیدی ‭(SNP) ‬بدست آمد که با تعیین توالی بیش از ‮‭14/4‬ میلیارد نوکلیوتید از ژنوم دو گونه تاسماهی ایرانی و روسی شمال و جنوب خزر، اثبات نمود که تاسماهی ایرانی یک گونه مستقل از تاسماهی روسی است. این دستاورد ارزشمند بعنوان بزرگترین دستاورد علمی در تمایز دو گونه از تاسماهیان مهم تجاری دریای خزر در دو دهه اخیر محسوب میشود. کلمات کلیدی: تاسماهی ایرانی، تاسماهی روسی، تمایز گونه ای، مارکر مولکولی ، ‭SNP ‬، دریای خزر،