شناسایی عامل لکه برگی پامچال در استان مازندران با استفاده از توالی ژن های rpoD و dnak

بیماری لکه برگی ناشی از گونه ای زانتوموناس در پامچال وحشی (Primula vulgaris) در چند منطقه جنگلی استان مازندران گزارش شده است (Rahimian. ۱۹۹۵. ۱۲th  Iran. Plant Protec. Cong.,۲۷۸). براساس یک بررسی ژنومی از تعیین توالی ناحیه ITS و ژن ۱۶s rRNA گزارش گردید که برخی از جدایه های عامل لکه برگی پامچال نزدیک به گونه X.campestris می باشند (Rahimian et al. ۲۰۰۸. ۱۸th  Iran. Plant Protec. Cong.,۴۲۰)، ولی اطلاع دقیقی از موقعیت تاکسونومیکی این جدایه ها در دسترس نیست. بررسی حاضر به منظور ارزیابی موقعیت تاکسونومیکی جدایه های به دست آمده از چند منطقه جنگلی استان مازندران انجام گرفت. ازکشت نمونه های پامچال دارای علایم لکه برگی، جدایه هایی با کلنی های محدب زرد رنگ و لعابدار روی محیطNAS  به دست آمد. واکنش فوق حساسیت پس از تزریق سوسپانسیون باکتری به برگ های شمعدانی بعد از ۲۴ ساعت و بیماری زایی روی برگ های پامچال پس از ۷ تا ۱۴ روز به اثبات رسید. نقوش الکتروفورزی پروتئین های سلولی اختلاف چندانی میان جدایه ها نشان نداد. از نظر ویژگی های فنوتیپی جدایه ها بسیار شبیه هم بوده و فقط در مصرف اسید سیتریک به عنوان منبع کربن اختلاف نشان دادند. DNA ژنومی جدایه ها استخراج و با به کارگیری آغازگرهای  dnakو rpoD قطعاتی از این دو ژن با PCR در شرایط توصیه شده پارکینسون و همکاران (Parkinson et al. ۲۰۰۷. Int. J. Syst. Evol. MicrobioI. ۵۷:۲۸۸۱-۲۸۸۷) ولی با کاهش دمای مرحله اتصال (Annealing) تکثیر شد. محصول PCR در ژل آگارز ۱% الکتروفورز و ژل در محلول ژل رد(gel red) رنگ آمیزی شد. به ترتیب دو قطعه ۹۶۵ و۷۳۶ bp از ژن های  dnakو rpoDتکثیر گردید. به منظور امکان تفکیک محصولPCR  جدایه ها از یکدیگر هضم محصول حاصل از تکثیر ژن های dnak وrpoDبا آنزیم  BamHIصورت گرفت. از ضریب تشابه جاکارد برای تعیین تشابه جدایه ها و از روش  UPGAMAو نرم افزار NTSYS برای آنالیز خوشه ای استفاده شد. نمونه های انتخاب شده براساس نتایج RFLP، توالی یابی شد. توالی نوکلئوتیدی به دست آمده، پس از همردیف سازی چندگانه (Multiple sequence alignment) با برنامه MEGA۴ با سایر توالی های مربوط به این ناحیه در گونه های مختلف Xanthomonas موجود در ژن بانک (NCBI) مقایسه شدند. نتایج به دست آمده نشان داد جدایه ها درسطح تشابه ۹۸% با گونه Xanthomonas hortorum شباهت داشته و احتمالا به پاتوار گزارش نشده ای از این گونه تعلق دارند. این اولین گزارش از جدایه هایی از گونه X.hortorum به عنوان عامل بیماری لکه برگی در پامچال است.