ساخت ناقل هدف گیری ژن برای تولید موش دارای فاکتور هشت ناک اوت شده

حیوانات ناک اوت شده برای مطالعه عملکرد ژن های انسانی مهم هستند. ساخت یک وکتور مناسب برای هدف گیری ژن مرحله ایی مهم در تولید موش ناک اوت شده است. این وکتورها معمولا برای هدف قرار دادن ژن مورد نظر به وسیله نوترکیبی همولوگوس طراحی شدهاند و نیاز به دو بازو با 100 درصد همولوژی با نواحی فلانکینگ توالی هدف دارند.فاکتور 8 انعقادی انسانی یک گلیکوپروتئین بزرگ است که به عنوان یک زنجیره منفرد با دومین های ساختاریA1-A2-BA3-C1-C2 سنتز می شود. اگزون 7 فاکتور 8 بخش انتهایی ناحیهA1را رمزگشایی می کند که داری نقش کلیدی در اتصال فاکتور 8 بهBipمی باشد. بنابراین هر جهشی در این ناحیه منجر به ممانعت از ترشح فاکتور 8 می شود. به منظور تولید موش هموفیل غیرفعال سازی فاکتور 8 موش به وسیله هدف قرار دادن اگزون 7 براساس نوترکیبی همولوگوس در نظرگرفته شد. دو بازوی بلند و کوتاه به ترتیب با طول 5100 و 1730 نوکلنوتید مرتبط با ناحیه فلانکینگ انتخاب و به ترتیب باPCRدو و یک مرحله ای تکثیر شد. قطعات تکتیر شده بعد از همسانه سازی در ناقلTA در ناقل ناک اوت قرار داه شد و ژن مقاومت به نئومایسین بین دو بازودرج شد. بعد از تایید، ناقل خطی شده نوترکیب برای انتقال به سلول های بنیادین جنین موش رشد کرده روی لایه فیبروبلاست جنینی موش استفاده شد. به دنبال انتخاب ترانسفکت ها به ترتیب با استفاده ازنئومایسین و گانسیکلوویر، یک تعداد از کلون های ES ظاهر شدند که با هدف جداسازی کلون های صحیح ناک اوت فاکتور 8 آنالیزخواهند شد که نهایتا برای تزریق به بلاستوسیست استفاده خواهند شد

کلیدواژه ها:

موش تراریخت ، هموفیلی ، فاکتور 8 ، ناک اوت